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誰(shuí)發(fā)明了基因編輯工具CRISPR-Cas9？

【新聞事件】：1月4日美國證券交易委員會(huì )（SEC）公布，CRISPR基因編輯公司Editas Medicine遞交了在納斯達克掛牌上市的申請文件，計劃募集1億美元。同一天人們也開(kāi)始注意到，之前吵得沸沸揚揚關(guān)乎Editas命脈的CRISPR專(zhuān)利戰又有了一些變化：美國專(zhuān)利與商標局（PTO）證實(shí)，責任審查員Michelle Joike建議由上訴委員會(huì )直接審核以加州大學(xué)伯克利分校Jennifer Doudna和她的同事作為申請人的CRISPR專(zhuān)利申請。這種叫做“Interference proceeding”（專(zhuān)利抵觸程序）的罕見(jiàn)專(zhuān)利審核程序意味著(zhù)加州貝克萊的專(zhuān)利審核不再是傳統意義上的專(zhuān)利授權，而是同時(shí)挑戰之前已經(jīng)授權的相關(guān)專(zhuān)利。程序上也更象法庭設置，由專(zhuān)利申請人和被挑戰的授權專(zhuān)利發(fā)明人在三位法官評判下“當面對質(zhì)”，以便確認專(zhuān)利的最終授權，即挑戰者可以接手已授權專(zhuān)利。這樣又把誰(shuí)是“自DNA雙螺旋結構之后基因工程領(lǐng)域最大的科學(xué)發(fā)現”的發(fā)明人這一熱門(mén)話(huà)題再次帶入公眾視野。

【藥源解析】：CRISPR-Cas是在大多數細菌和古細菌中發(fā)現的一種天然免疫系統，可用來(lái)對抗入侵的病毒及外源DNA。當原核生物遇到外源的核酸比如病毒基因組或者質(zhì)粒的時(shí)候，一些原核生物把一部分很短的外源序列整合到自己的一個(gè)或者多個(gè)CRISPR位點(diǎn)，接著(zhù)CRISPR位點(diǎn)被轉錄生成CRISPR RNAs（crRNAs)。crRNA隨后會(huì )引導DNA剪切酶Cas9根據序列互補的原則剪切未來(lái)入侵的外源核酸序列。所以俗稱(chēng)“魔術(shù)剪刀”的CRISPR-Cas9基因編輯技術(shù)是由一段介導RNA序列加上一個(gè)DNA水解酶Cas9組成，可以附著(zhù)在基因組上幾乎任何一個(gè)位置，并由Case9蛋白切開(kāi)DNA序列的特定位點(diǎn)，然后在這個(gè)位點(diǎn)刪除或添加特定的DNA片段（如圖電影剪接）。所以CRISPR-Cas理論上不僅可以用作從基礎研究到新藥研發(fā)的工具，也可以修復變異的DNA因此作為藥物治療某些遺傳疾病。除此之外CRISPR/Cas9使用簡(jiǎn)便、成本低廉，一些試劑公司比如Sigma/Aldrich已經(jīng)開(kāi)始接受不同CRISPR-Cas9的定制服務(wù)。《科學(xué)》雜志把CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)評為2015年最重要的“突破性發(fā)現”，更多科學(xué)家認為CRISPR/Cas9是自20世紀70年代生物技術(shù)時(shí)代以來(lái)出現的最重要的基因工程技術(shù)。

那么誰(shuí)是最早發(fā)現、發(fā)明CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)的科學(xué)家呢？筆者以為應該至少從“CRISPR/Cas9的基礎研究”，“CRISPR/Cas9在人類(lèi)細胞中的具體應用”、和“CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)的法律發(fā)明人”三個(gè)方面討論。

無(wú)容置疑，加州伯克利分校的結構生物學(xué)家Jennifer Doudna教授和德國亥姆霍茲醫學(xué)研究中心的Emmanuelle Charpentier教授是最早報道把細菌天然免疫系統演變成CRISPR/Cas9基因編輯工具的科學(xué)家。2012年6月，Doudna/Charpentier聯(lián)合課題組在《科學(xué)》雜志上發(fā)表CRISPR/Cas9作為基因編輯技術(shù)的第一篇研究論文，首次在體外證明CRISPR/Cas9技術(shù)可以切割任何的DNA鏈，指出CRISPR在活細胞中修改基因的能力，并且完整的討論了CRISPR在基因組編輯上的可行性。正是Doudna和Charpentier的這些基礎研究使CRISPR作為一種基因組編輯技術(shù)成為可能，也使生物學(xué)家認識到CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)的廣闊應用前景。Jennifer Doudna和Emmanuelle Charpentier因此也在2014年11月獲得了由互聯(lián)網(wǎng)巨頭設立的獎金高達300萬(wàn)美元的生命科學(xué)突破獎（Breakthrough Prizes）。CRISPR被譽(yù)為本世紀到目前為止生物技術(shù)領(lǐng)域的最大突破。

在CRISPR/Cas9技術(shù)于人類(lèi)細胞中的具體應用領(lǐng)域，2013年1月，哈佛大學(xué)的George Church實(shí)驗室和麻省理工學(xué)院/哈佛大學(xué)的Broad研究所的張鋒課題組在同一期的《科學(xué)》雜志上發(fā)表文章，證實(shí)了CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)被成功地運用到人類(lèi)細胞的基因組，實(shí)現了CRISPR在哺乳動(dòng)物細胞的基因編輯。幾周后Jennifer Doudna也發(fā)表了她們自己實(shí)驗室的類(lèi)似結果。

在知識產(chǎn)權方面，Jennifer Doudna和Emmanuelle Charpentier在2012年5月25號申報了CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)的第一個(gè)專(zhuān)利申請（優(yōu)先權日期2012年5月25號），包含了該項技術(shù)在不同種類(lèi)細胞中應用的155項權利要求。但到目前為止她們的所有CRISPR/Cas9專(zhuān)利申請都沒(méi)有獲得授權。麻省理工/哈佛Broad研究所的張鋒也自2012年12月12號開(kāi)始申報了CRISPR-Cas9技術(shù)在真核生物上進(jìn)行了基因組編輯的超過(guò)20項專(zhuān)利（第一個(gè)CRISPR-Cas9專(zhuān)利申請到優(yōu)先權日期是2012年12月12號）。廣泛涵蓋了該項技術(shù)在真核細胞或者任何細胞有細胞核的物種中，以及針對不同適應癥的各種應用。因為Broad研究所支付額外的費用，張峰的CRISPR/Cas9專(zhuān)利申請獲得“快速通道”審核，PTO在2014年4月授予了張鋒和Broad研究所首個(gè)CRISPR專(zhuān)利（專(zhuān)利號：US8697359）。到目前為止張峰的專(zhuān)利申請已經(jīng)有14個(gè)獲得授權，在歐洲也有4個(gè)已經(jīng)被批準。

雖然Doudna/Charpentier聯(lián)合課題組的專(zhuān)利申請早于張峰的CRISPR/Cas9專(zhuān)利申請，但因為直到2013年3月16日才實(shí)行新的“first to file規則”，而Doudna/Charpentier和張峰的專(zhuān)利申請都早于這個(gè)日期，美國專(zhuān)利授權仍按照較老版本的“first to invent規則”進(jìn)行，即誰(shuí)能夠證明自己是第一個(gè)發(fā)明了CRISPR誰(shuí)就獲得專(zhuān)利，因此致使CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)的專(zhuān)利大戰變得撲朔迷離。雖然Doudna和Charpentier于2012年5月就遞交了專(zhuān)利申請，比張鋒早7個(gè)月。但據說(shuō)張鋒提交了他的實(shí)驗室筆記本后證實(shí)，他在2011年就開(kāi)始有了把Cas蛋白簇和tracrRNA放到哺乳動(dòng)物細胞中的想法，并開(kāi)始了CRISPR技術(shù)在人類(lèi)細胞中的基因編輯，而且獲得了第一個(gè)專(zhuān)利授權。當然，CRISPR/Cas9專(zhuān)利大戰的勝負將取決于“CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)發(fā)明”的定義（是否在試管里進(jìn)行基因編輯也算？，和這兩個(gè)課題組誰(shuí)能證明更早地成功地開(kāi)展這些實(shí)驗。如果Doudna/Charpentier的律師能使上訴委員會(huì )確信其《科學(xué)》文章發(fā)表后，CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)在細胞中如何使用變得顯而易見(jiàn)（obviousness），Doudna/Charpentier也能贏(yíng)得CRISPR/Cas9的最終專(zhuān)利授權。

從以上分析可看出，Jennifer Doudna、Emmanuelle Charpentier、張峰、和George Church是相對獨立地發(fā)明CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)的科學(xué)家，其中Jennifer Doudna和Emmanuelle Charpentier重在CRISPR/Cas9技術(shù)的基礎研究，而張峰和George Church在各種人類(lèi)細胞中的應用方面貢獻較多。至于CRISPR/Cas9技術(shù)的專(zhuān)利授權最終花落誰(shuí)家，雙方提供的證據說(shuō)話(huà)。

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